ELISA是蛋白定量的金規(guī)范，也是免疫學(xué)研討中常用的試驗(yàn)辦法之一。很多人覺(jué)得ELISA很簡(jiǎn)單，其實(shí)不然。今天研域生物帶你繞開(kāi)ELISA試驗(yàn)中呈現(xiàn)的各種問(wèn)題，輕松搞定ELISA試驗(yàn)~

1.間接法

檢測(cè)抗體常用的辦法, 首要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)。
優(yōu)勢(shì)：二抗能夠加強(qiáng)信號(hào)，并且有多種挑選能做不同的測(cè)定剖析。不加酶符號(hào)的一級(jí)抗體則能保存它多的免疫反應(yīng)性。
缺點(diǎn)：交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高

2.雙抗體夾心法

檢測(cè)大分子抗原常用的辦法。
優(yōu)勢(shì)：高活絡(luò)、高專(zhuān)一性，抗原無(wú)須事前純化。
缺點(diǎn)：抗原必定得具有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。

3.競(jìng)爭(zhēng)法

檢測(cè)小分子半抗原（藥物、激素等）。
優(yōu)勢(shì)：可適用比較不純的樣本，并且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。
缺點(diǎn)：整體的敏感性和專(zhuān)一性都較差。

常見(jiàn)問(wèn)題剖析

Q1.標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色

溶解規(guī)范品以及倍比稀釋時(shí)，未渦旋震動(dòng)或不行充沛。
規(guī)范品溶解、倍比稀釋時(shí)均需求渦旋震動(dòng)以保證充沛混勻。單純依托移液器重復(fù)吹打，效率較低、作用也不必定jia。

Q2.標(biāo)曲和樣本均不顯色

在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充沛接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。
推薦孵育階段，運(yùn)用ELISA的微孔板振蕩器，調(diào)至適宜的頻率，使抗原抗體充沛接觸，保證結(jié)合作用。假如排除上述原因，有可能是漏加了某個(gè)組分，如檢測(cè)抗體、酶等。關(guān)于比較大意的新手，必定要做好符號(hào)和記錄，或者運(yùn)用增加染料的ELISA試劑盒。

Q3.標(biāo)曲顯色，樣本不顯色

當(dāng)樣本中意圖蛋白濃度極低或者樣本中攪擾要素較強(qiáng)，就無(wú)法檢測(cè)到。現(xiàn)在ELISA仍然是蛋白檢測(cè)活絡(luò)度gao的辦法，與不同技能結(jié)合后，衍生出了多種類(lèi)型的ELISA，提高了檢測(cè)活絡(luò)度。

關(guān)于意圖蛋白濃度特別低的樣本，能夠嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著必定能檢測(cè)到樣本濃度，只能說(shuō)能夠提高樣本的可測(cè)率，并使成果愈加牢靠。因?yàn)橥ǔＳ靡话鉋LISA檢測(cè)的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也愈加可信。

Q4.標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大

這個(gè)問(wèn)題就跟移液器和試驗(yàn)者的操作有關(guān)了。移液器的運(yùn)用維護(hù)不規(guī)范，就會(huì)造成移液的誤差較大；試驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對(duì)復(fù)孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確運(yùn)用和維護(hù)。關(guān)于個(gè)人的操作可操練移液動(dòng)作、加快速度，保證移液的精密度。

Q5.本底偏高，樣本值測(cè)不到標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(關(guān)于高敏ELISA能夠恰當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時(shí)分，本底過(guò)高會(huì)掩蓋意圖信號(hào)，導(dǎo)致無(wú)法測(cè)到樣本值。
在參加TMB顯色后，需實(shí)時(shí)觀察標(biāo)曲顯se狀況。通常在S5孔有肉眼可見(jiàn)的微弱藍(lán)色，即可停止反應(yīng)。

Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋?zhuān)怂愕玫降臉颖局挡町愝^大

有時(shí)分咱們不清楚樣本中意圖蛋白的濃度怎么，應(yīng)該怎么稀釋?zhuān)敲丛蹅兙蜁?huì)做下預(yù)試驗(yàn)，確認(rèn)稀釋倍數(shù)。但是有時(shí)分同一樣本做了幾個(gè)不同梯度稀釋后，核算得到的樣本值之間差異較大，應(yīng)該挑選哪一個(gè)稀釋倍數(shù)呢？

這里觸及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時(shí)，血清中的各種蛋白會(huì)抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較顯著。而經(jīng)過(guò)稀釋后，攪擾要素也隨之稀釋?zhuān)绊懢蜁?huì)較小。當(dāng)某兩個(gè)梯度稀釋后，核算得到的樣本值挨近時(shí)，咱們就能夠以為在該稀釋梯度時(shí)，樣本中的攪擾要素影響較小，核算得到的值也是挨近真實(shí)的。但是這樣的稀釋是針對(duì)意圖蛋白濃度較高的樣本而言。關(guān)于濃度很低的樣本，經(jīng)過(guò)多倍稀釋后，就愈加測(cè)不到了，此刻可依照廠家說(shuō)明書(shū)推薦的加樣方法操作。

Q7.不同試劑盒中的組分能否通用

除非是共用的試劑如洗液、檢測(cè)緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，乃至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包含規(guī)范品、規(guī)范品稀釋液、檢測(cè)抗體、酶等)都是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，假如輕率運(yùn)用其它試劑盒的組分，有可能對(duì)成果產(chǎn)生影響。