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谷胱甘肽作為脂質(zhì)過氧化損傷指標(biāo)的研究
發(fā)布時間： 2010-04-29 點(diǎn)擊次數(shù)： 2450次谷胱甘肽（GSH）是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的小分子三肽化合物，它參與細(xì)胞內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、糖代謝和DNA合成調(diào)節(jié)，在拮抗外源性毒物、氧自由基損傷、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、維持細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用［1］。多年來，人們試圖根據(jù)GSH被氧化還原的程度來評估氧自由基脂質(zhì)過氧化損傷，并取得了不少進(jìn)展。
一、谷胱甘肽的一般生理特性
GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，是細(xì)胞內(nèi)呈液態(tài)、含巰基zui為豐富的一類化合物，半胱氨酸α氨基上的-SH為該分子化合物活性中心。GSH在不同臟器濃度不同，以肝內(nèi)zui高，依次為脾、腎、肺、腦、心、胰和骨髓，血液中濃度zui低［2］；同一器官不同部位濃度相差亦較大，而同一細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器間GSH含量亦不一致。
谷胱甘肽氧化型（GSSG）為GSH的氧化形式，在氧化劑作用下GSH通過GSH-過氧化物酶（GSH-Px）氧化成GSSG；后者通過NADPH供氫，在谷胱甘肽還原酶（GSH-Rx）作用下又還原成GSH，二者構(gòu)成一動態(tài)平衡，使GSSG維持在總GSH量的1％～10％水平［3］，構(gòu)成一有效的抗氧化系統(tǒng)。生理狀態(tài)下，GSH/GSSG維持在高比率，而在氧化應(yīng)激時，GSH氧化成GSSG，GSH/GSSG比率下降，故可借以評估脂質(zhì)過氧化損傷情況。
GSH合成主要在肝內(nèi)，其合成除與半胱氨酸及NADPH含量有關(guān)外，其合成限速酶谷胱甘肽合成酶（GCS）亦有重要作用。GCS有2個亞基GCLR和GCLS，以GCLR為主，GCLS起調(diào)節(jié)作用。在氧化狀態(tài)，GCLR的mRNA高表達(dá)且有劑量依賴性，而低水平GSH對GCLR的mRNA影響則不明顯；相反，抑制GSH-Rx后，GCLR的mRNA則高表達(dá)，提示GSSG對GCLR有調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)而反饋性調(diào)節(jié)GSH水平［4］。GSH清除主要在腎臟，占血循環(huán)總量50％～65％，雙腎動脈中80％的GSH和GSSG經(jīng)一次腎循環(huán)后被濾過，但可經(jīng)Na+-依賴性GSH酶轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)重吸收。
二、GSH拮抗自由基脂質(zhì)過氧化損傷機(jī)理
GSH在拮抗氧化性毒物中發(fā)揮重要作用，一方面可與毒物分子及其代謝物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)降低毒物毒性；另一方面可通過氧化還原反應(yīng)而降低毒物過氧化的能力，使含巰基酶免于被重金屬和氧化劑激活或使已氧化的含巰基酶還原而使其恢復(fù)活性。
在自由基大量產(chǎn)生時，細(xì)胞膜不飽合脂肪酸氧化成脂過氧基，并引起一系列繼發(fā)損傷。GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，終止連鎖反應(yīng)，其本身則被氧化成GSSG。同樣，GSH在對抗氧自由基過氧化并抑制由此引發(fā)的細(xì)胞凋亡、壞死及自穩(wěn)態(tài)改變等方面亦發(fā)揮著重要作用。
GSH/GSSG體內(nèi)代謝有多種途徑，在氧化狀態(tài)下，GSH一方面被氧化成GSSG，表現(xiàn)為相應(yīng)GSH/GSSG的降升；另一方面，GSH與外源毒物及其代謝物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，zui終生成硫醇脲酸經(jīng)尿排出，此時僅為相應(yīng)GSH下降，而GSSG變化可能并不大，甚或因GSH消耗而GSSG亦降低［5］。GSSG除可被還原成GSH外，還可通過GST（谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。
三、體內(nèi)影響GSH水平因素
由于血中GSH主要源于肝臟等器官，所以血漿GSH水平無疑是間接反映有關(guān)器官，如肝、腎內(nèi)GSH水平的較理想指標(biāo)。目前測定仍多停留在動物實(shí)驗(yàn)階段，有關(guān)人血GSH濃度報(bào)道較少，近期報(bào)道人血濃度為1.000±0.167（715例）［1］。
在許多病理情況下，如糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、外源性毒物致過氧化時，GSH水平下降。近期又發(fā)現(xiàn)艾滋病、帕金森病、衰老及低氧血癥病人的GSH也下降，并發(fā)現(xiàn)老年人伴GSH低下者的身體健康狀況較高GSH者差。
Hagg等報(bào)道，在生理狀態(tài)下男性GSH水平高于女性，素食者高于非素食者，老年人GSH明顯下降，黑人GSH高于白種人［1，6］。另外人們還發(fā)現(xiàn)，GSH水平與體育活動程度及營養(yǎng)有關(guān)。有趣的是，吸煙者GSH高于非吸煙者，這可能是機(jī)體對長期吸煙引起慢性氧化狀態(tài)的適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)，這也進(jìn)一步提示，GSH在體內(nèi)抗氧化過程中的重要作用。
四、不同化學(xué)毒物誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化狀態(tài)下GSH/GSSG的變化
體外試驗(yàn)顯示，當(dāng)細(xì)胞暴露于亞毒性濃度毒物時，GSH并不下降而是升高。 Cookson等［7］用神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分別與亞毒性濃度*基錫、三乙基錫共同培養(yǎng)24小時，細(xì)胞內(nèi)GSH顯著升高；Ochi［8］用中國倉鼠V79細(xì)胞與亞毒性濃度砷共同孵育時，發(fā)現(xiàn)在8小時GSH升高zui大，之后降低；另外，亦有大量試驗(yàn)顯示暴露于亞毒性濃度的鉛、汞、甲基汞等化合物亦使GSH升高［9］，提示可能是細(xì)胞在應(yīng)激時采取的一種保護(hù)性機(jī)制，與長期吸煙致GSH升高情況類似。
Palmeira等［10］將雄性Wistar大鼠肝細(xì)胞分別和不同毒性濃度的除莠劑百草枯和2,4-D共同進(jìn)行體外培養(yǎng)，用Hissin酶化學(xué)法檢測GSH/GSSG。結(jié)果顯示，GSH濃度隨接觸時間而降低，孵育2～3小時降至zui低水平，且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，而GSSG則呈正比升高。Lora等用雄性Fischer344大鼠與不同濃度的雙氯乙基亞硝脲一起孵育并采用反相液相色譜（HPLC）法檢測GSH/GSSG水平，亦得出同樣結(jié)論［11］。
而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，情況則復(fù)雜得多。Stone等［12］以不同濃度的維生素K3（0、30、60和100 μmol/L）對鼠染毒，用Hissin-Hilf酶化學(xué)法分別測定GSH/GSSG，結(jié)果顯示GSH降低及GSSG升高具有劑量依賴關(guān)系，但GSH下降與GSSG升高不成等比例，當(dāng)GSH值（μmol/g）由1.45±0.28降到0.57±0.07時（61％），GSSG此時升高僅為GSH丟失的10％。有研究用甲醇（3.0和6.0 g/kg）對雄性大鼠染毒，并分別于不同時間測其肝細(xì)胞、紅細(xì)胞及血漿GSH/GSSG，結(jié)果顯示3.0 g/kg組GSH 12小時達(dá)zui低，從4.4 μmol/g降至3.4 μmol/g（P＜0.05），其后緩慢恢復(fù)，GSH-Px、GSH-Rx活性與GSH亦同步升降，但GSSG變化則不明顯，這可能是由于GSH與新生成的甲醛直接結(jié)合而未生成GSSG［13］。另有實(shí)驗(yàn)則顯示由于GSH與毒物結(jié)合，GSSG生成也減少，GSH/GSSG比率反較前升高［5，13］。
有些實(shí)驗(yàn)顯示，外周血GSSG變化較GSH敏感，這可能與細(xì)胞受損后GSH、GSSG釋放到細(xì)胞外水平不同有關(guān)。Navarro等［14］對成年OF1小鼠給予1～7 Gy的高能X線照射，并在不同時間測其血中GSH/GSSG。此外，對患乳腺癌及肺癌病人在接受不同劑量放射治療時亦采用HPLC法測定上述指標(biāo)，結(jié)果顯示小鼠血中GSH濃度變化不顯著，GSSG升高，GSH/GSSG下降，并與放射劑量有劑量和時間依賴性，尤以2 小時GSSG升高zui顯著；鼠肝、心、胰腺中變化亦明顯，且同時有GSH下降并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腫瘤放療病人結(jié)果亦顯示外周血GSSG水平則隨放療累積量增加而升高，并有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而GSH變化則不顯著。
但在以該指標(biāo)評估脂質(zhì)過氧化損傷時，尚需注意到GSH/GSSG系統(tǒng)的參與情況。Lii等［15］采用雄性SD大鼠，分別予以百草枯（20和40 g/kg）、敵草快（85和190 mg/kg）染毒，結(jié)果見肝細(xì)胞GSH和GSSG及其比率變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而此時通過檢測氧自由基脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物硫巴比土酸反應(yīng)物，則顯示肝細(xì)胞有較嚴(yán)重氧自由基脂質(zhì)過氧化損傷，這可能與蛋白質(zhì)-S-谷胱甘肽化有關(guān)，GSH/GSSG 系統(tǒng)則可能未參與上述過程。
以GSH/GSSG作為指標(biāo)評估脂質(zhì)過氧化損傷，諸多實(shí)驗(yàn)結(jié)果有不小差異，可能與以下因素有關(guān)：
1．測量方法：檢測GSH/GSSG方法有多種，歸納起來主要有2類：酶化學(xué)法和HPLC法。前者主要根據(jù)GSH在氧化還原過程中酶代謝動力學(xué)改變，如利用GSH被二硫代*氧化，生成硫硝基苯酸鹽的程度，間接反應(yīng)GSH/GSSG的水平。HPLC法則可據(jù)實(shí)驗(yàn)波譜直接測定GSH/GSSG，敏感性、專一性較高，但操作復(fù)雜。兩種方法的結(jié)果多數(shù)一致［1，15］，而Floreani等［16］則認(rèn)為HPLC較化學(xué)法敏感10倍以上，兩方法所測結(jié)果有顯著差別，但都面臨同樣問題，如GSH/GSSG在細(xì)胞內(nèi)隔窒化（compartmentilization）和樣本的預(yù)處理等。
2．質(zhì)量控制：GSH接觸到空氣時，如不用穩(wěn)定劑，可迅速被氧化而消耗；在不同溫度下，其穩(wěn)定性亦不一，如血樣獲取后立即在-70℃冷凍，GSH至少可保持3周，但在-20～4℃，GSH逐漸降解；而加入穩(wěn)定劑后，-20℃下可存放1年，室溫下亦可放置1天。所以樣品的預(yù)處理對所測結(jié)果有直接而十分重要的影響。
3．機(jī)體的多抗氧化體系和GSH/GSSG代謝的多途徑：如機(jī)體通過蛋白質(zhì)-S-谷胱甘肽化、碳酸酐酶Ⅲ發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞作用等，此時GSH/GSSG系統(tǒng)并未參與抗氧化代謝；生理狀態(tài)下GSH/GSSG防御系統(tǒng)受到諸多酶活性制約，而病理狀態(tài)下酶活性的改變亦會影響GSH/GSSG水平；GSH和GSSG還有著多種代謝途徑，如GSSG不升高，可以反映低水平脂質(zhì)過氧化或低GSH含量，但亦可能因GSH與毒物直接結(jié)合而不形成GSSG或新產(chǎn)生的GSSG又發(fā)生新結(jié)合反應(yīng)等。
綜上所述，GSH/GSSG可作為評價氧自由基脂質(zhì)過氧化損傷的較敏感指標(biāo)，并可借以探究毒物毒性機(jī)理，但仍需要根據(jù)毒物種類、濃度和相互作用時間等不同，對GSH/GSSG做綜合分析；此外，GSH/GSSG作為氧自由基損傷指標(biāo)的研究目前仍多處于動物實(shí)驗(yàn)階段，而對人體研究則較少，對其特異性的提高仍是有待解決的問題。應(yīng)用到對人群的監(jiān)控或?qū)εR床中毒病人的評估仍有一定距離。
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